Blog

May 09, 2023

La compleja regulación de la competencia en Staphylococcus aureus en condiciones microaeróbicas

Volumen de biología de las comunicaciones

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 512 (2023) Citar este artículo

399 Accesos

3 Altmetric

Detalles de métricas

Para realizar la transformación natural, uno de los tres mecanismos principales de transferencia horizontal de genes, las bacterias necesitan entrar en un estado fisiológico diferenciado llamado competencia genética. Curiosamente, a menudo se descubren nuevas bacterias que muestran tal aptitud, y una de las últimas es el patógeno humano Staphylococcus aureus.

Aquí, mostramos un protocolo optimizado, basado en cultivos de células planctónicas, lo que lleva a un gran porcentaje de la población a activar el desarrollo de competencia y una mejora significativa de las eficiencias de transformación natural de S. aureus. Aprovechando estas condiciones, realizamos análisis de transcriptómica para caracterizar el regulón de cada regulador de competencia central. Tanto SigH como ComK1 se consideran esenciales para activar genes de transformación natural, pero también son importantes para la activación o represión de funciones periféricas. Aunque ComK2 no se considera importante para el control de los genes de transformación, su regulón muestra una superposición importante con la de SigH y ComK1. Finalmente, proponemos que las condiciones microaeróbicas, detectadas por el sistema de dos componentes SrrAB, son clave para activar la competencia en S. aureus.

Un organismo comensal altamente adaptable, como Staphylococcus aureus, posee una serie de genes que permiten que la bacteria crezca, infecte y sobreviva en una amplia variedad de nichos ecológicos. Las fosas nasales anteriores generalmente se consideran el nicho ecológico nativo de S. aureus, aunque la bacteria se puede aislar de otras áreas del cuerpo humano, como la piel, las axilas, la ingle y el tracto gastrointestinal1. Si bien la colonización generalmente no es dañina, S. aureus puede violar las defensas innatas del huésped y obtener acceso a tejidos más profundos, causando una variedad de infecciones superficiales e invasivas2. Además, como anaerobio facultativo, S. aureus tiene la capacidad de crecer y frustrar el sistema inmunitario del huésped en presencia o ausencia de oxígeno. Esta capacidad es particularmente importante para S. aureus ya que se sabe que su entorno es o se vuelve anaeróbico durante el curso de una infección3,4.

Además de estos notables poderes de adaptación, S. aureus también se convirtió en uno de los patógenos más temidos en el hospital debido a la aparición generalizada de cepas multirresistentes a los antibióticos5,6. Durante años se pensó que la transferencia horizontal de genes (HGT) de genes de resistencia a antibióticos de otras cepas de S. aureus o incluso de otros géneros estaba mediada exclusivamente por conjugación y transducción7. Sin embargo, hace unos años, la demostración de que S. aureus es capaz de volverse naturalmente competente para la transformación genética8 cambió nuestra forma de aprehender la HGT en este importante patógeno humano.

La competencia es una adaptación fisiológica que algunas especies bacterianas desarrollan en respuesta a diversas señales ambientales9. En respuesta a estos estímulos, las células bacterianas desencadenan vías de transducción de señales y, en última instancia, activan los reguladores de competencia central. Todos estos pasos están controlados por los llamados genes de competencia temprana. Curiosamente, los reguladores de competencia central se han identificado en varios organismos modelo como activadores transcripcionales10,11 o factores sigma alternativos12. Una vez activados, inician la expresión de los genes de competencia tardía, entre los que se encuentran todos los genes esenciales para la transformación genética.

Es importante destacar que se han identificado tres reguladores de competencia central potenciales en S. aureus: el factor sigma alternativo, SigH13, y dos reguladores transcripcionales, ComK1 y ComK214. Además, se ha demostrado que S. aureus es capaz de inducir naturalmente la competencia en un medio químicamente definido llamado CS28. Los autores detectaron un máximo de 1,6% de células inductoras de competencia después de 8 h de crecimiento en el medio CS2, lo que llevó a eficiencias de transformación que apenas alcanzaron el límite de detección (alrededor de 10−10) para una cepa de tipo salvaje8.

En este estudio, nuestro principal objetivo fue caracterizar el desarrollo de competencia en el patógeno humano S. aureus. Nuestro objetivo era investigar todos los pasos involucrados, desde los estímulos ambientales detectados por las células y las vías de transducción de señales hasta los reguladores de competencia central y sus regulones. Para alcanzar tales objetivos, primero desarrollamos un protocolo para optimizar el desarrollo de la competencia y la transformación genética en cultivos planctónicos de S. aureus. Luego, utilizando varias cepas reporteras y análisis transcriptómicos globales, analizamos el papel de los tres reguladores centrales durante el desarrollo de la competencia en S. aureus. En particular, demostramos que, si bien SigH y ComK1 son esenciales para la expresión de los genes involucrados en la transformación genética, los tres reguladores (SigH, ComK1 y ComK2) son necesarios para el desarrollo completo del programa transcripcional de competencia. Finalmente, proponemos que la limitación de oxígeno, detectada por el sistema de dos componentes SrrAB (TCS), probablemente activando SigH, controla el desarrollo de competencia en el patógeno humano S. aureus.

Primero decidimos optimizar el protocolo publicado por Morikawa y sus colegas en 20128 (ver Material y métodos para más detalles). Para comparar nuestros resultados, utilizamos la misma cepa reportera, expresando el gen gfp bajo el control del promotor del operón de competencia tardía comG (PcomG-gfp)8. Brevemente, la cepa indicadora se sembró primero en una placa de agarosa BHI. A continuación, las colonias aisladas se utilizan para inocular un precultivo en el medio BHI. A continuación, este precultivo se detuvo rápidamente en crecimiento exponencial, se centrifugó, se lavó y se usó para inocular un cultivo fresco en un medio CS2. A partir de este cultivo inicial en CS2 fresco, se realizaron diluciones seriadas de diez veces en tubos Falcon cerrados. Finalmente, la densidad celular (OD600 nm) y el porcentaje de células competentes que expresan GFP se midieron mediante citometría de flujo en cada cultivo diluido cada 30 min. Curiosamente, la Fig. 1a, b demuestra cómo nuestro protocolo optimizado pudo inducir el desarrollo de competencia en hasta el 70 % de la población en un experimento determinado (en realidad, el análisis estadístico evaluó este porcentaje en el 52 ± 15 % de la población, n = 12). Este porcentaje, más de diez veces superior al de la literatura, se calculó previamente mediante la detección de células que expresan GFP por microscopía8. Por lo tanto, verificamos que las mediciones realizadas por citometría de flujo no introducirían ningún sesgo y proporcionarían resultados similares a los de la microscopía (Fig. 1 complementaria).

a Crecimiento de una cepa wild-type que expresa gfp bajo el control del promotor comG (St29) en medio CS2, entre 16 y 21,5 h. Se muestran las diluciones de 10−2 a 10−5. La dilución 10-2 ya estaba en fase estacionaria, mientras que la dilución 10-3 entraba en fase estacionaria después de 16 h de crecimiento. Las diluciones 10−4 y 10−5 estaban, respectivamente, en la fase exponencial tardía y temprana al comienzo del experimento. Todas las diluciones alcanzaron una DO final similar entre 2,4 y 2,6. b El porcentaje de células competentes se midió mediante citometría de flujo analizando el porcentaje de células que expresan GFP bajo el control del promotor comG (PcomG). En cada cultivo diluido presentado en el panel a), el porcentaje de células competentes que expresan GFP aumentó en la fase exponencial tardía y alcanzó un máximo en la entrada en la fase estacionaria. Este gráfico muestra un experimento representativo que se ha repetido tres veces (réplicas biológicas, consulte la Fig. 2a complementaria). c Eficiencias de transformación de cepas mutantes de tipo salvaje (N315ex sin Phi), comGA (St137), sigH (St45), comK1 (St37), comK2 (St38) y srrA (St117) usando plásmido (pCN34, KanR, barras blancas ) o ADN cromosómico (barras grises) (ver Material y métodos para más detalles). Los resultados se presentan como media ± SD. Para cada cepa, el experimento se repitió al menos cinco veces (repeticiones biológicas). Los experimentos individuales se muestran como círculos azules. d Eficiencias de transformación de cepas de laboratorio (N315, RN4220 y USA300) y aislamientos clínicos de MRSA (NL10, NL27) o MSSA (NL36) usando ADN cromosómico (barras grises) (ver material y métodos para más detalles). Los resultados se presentan como media ± SD. Para cada cepa, el experimento se repitió al menos cinco veces (repeticiones biológicas). Los experimentos individuales se muestran como círculos azules.

Luego confirmamos que nuestro protocolo optimizado, asociado con un mejor desarrollo de la competencia, también condujo a una mayor eficiencia de transformación. Curiosamente, en condiciones de laboratorio, una cepa de tipo salvaje N315 alcanzó una eficiencia de transformación de alrededor de 1,5 × 10−7 (±0,6 × 10−8) con un plásmido replicativo como ADN donante (Fig. 1c). Tal resultado es 1000 veces superior a lo publicado anteriormente8. Es importante destacar que la eficiencia de transformación incluso alcanzó 4.2 × 10-6 (± 4.1 × 10-6) cuando usamos un cromosoma de la cepa S. aureus (que alberga un marcador antibiótico, consulte Material y métodos) como ADN exógeno (Fig. 1c). Para confirmar definitivamente que las colonias que crecían en nuestros ensayos eran transformantes reales, también mostramos que no se podían detectar eventos de transformación utilizando una cepa en la que se eliminó comGA, un gen esencial para la transformación genética15 (Fig. 1c).

Es importante destacar que el protocolo descrito aquí y optimizado para la cepa N315 también conduce a otras cepas de laboratorio (RN4220 y USA300) y aislados clínicos (NL10, NL27 y NL36) a la transformación genética (Fig. 1d). Curiosamente, RN4220 mostró eficiencias de transformación muy altas (alcanzando 9,7 × 10−5 ±5,9 × 10−5) mientras que USA300 (7 × 10−8 ±6,9 × 10−8) y los aislados clínicos (NL10, 1,2 × 10−7 ± 3,79 × 10−7, NL27, 1,6 × 10−7 ±4,8 × 10−7 y NL36, 1,2 × 10−7 ±7,9 × 10−7) mostraron números más bajos que N315. Estos resultados demuestran claramente la solidez de nuestro protocolo, pero también que podría ser necesaria una mayor optimización para nuevas cepas.

La Figura 1 muestra claramente cómo se indujo la competencia en cada cultivo diluido usando nuestro protocolo optimizado. Cada dilución adicional se caracterizó por un retraso de 2 horas en el crecimiento (Fig. 1a). De hecho, la dilución 10−5 necesita más tiempo para alcanzar la fase estacionaria que la dilución 10−4, que necesita más tiempo que la dilución 10−3. En consecuencia, el desarrollo de la competencia también se retrasó en cada cultura diluida consecutiva (Fig. 1b). Sin embargo, las células competentes que expresan GFP siempre aparecieron cuando los cultivos se acercaron a OD = 2 y alcanzaron un máximo una vez que cada cultivo entró en la fase estacionaria (Fig. 1a, b).

Para verificar aún más la existencia de una correlación entre el desarrollo de competencias y la densidad celular, repetimos este experimento tres veces (Fig. 2a complementaria). Esta correlación mostró claramente que el desarrollo de la competencia en S. aureus cultivado en CS2 alcanzó un máximo cuando los cultivos entraron en la fase estacionaria con una DO600nm de alrededor de 2,4 (de hecho, entre 2,2 y 2,6) (Figura complementaria 2a). La alta densidad celular, detectada por las células bacterianas a través de la detección de quórum (QS), se ha propuesto y verificado en varios organismos modelo como un estrés importante que induce competencia16,17,18. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que un sistema QS podría estar involucrado en el desarrollo de la competencia en S. aureus. Curiosamente, se han identificado dos sistemas QS en S. aureus (Agr y Lux19). Por lo tanto, finalmente investigamos el impacto de la eliminación del gen agrA (que codifica el regulador transcripcional del sistema Agr, 19) y luxS (que codifica el regulador del sistema Lux, 19) en el desarrollo de la competencia. Sorprendentemente, ninguno de estos genes se encontró involucrado en la inducción de la expresión del operón comG (Fig. 2b complementaria). Este resultado pareció sorprendente, especialmente cuando se compara con datos recientes en los que la eliminación de agrAC disminuyó la competencia en un factor triple20. Aunque los protocolos utilizados en este estudio son diferentes a los nuestros, se requerirán más investigaciones para comprender por qué QS no parece estar involucrado en todas las condiciones.

Como se mencionó en la introducción, en la literatura se han identificado tres posibles reguladores de la competencia. Aunque se ha demostrado que SigH es importante para activar la expresión de PcomG8, no se ha asignado claramente ningún papel a ComK1 y ComK2. Aquí, utilizando nuestro protocolo optimizado, decidimos probar el efecto de la eliminación de sigH, comK1 y comK2 en la expresión de cuatro promotores: PcomG (un promotor que solo se activa con la sobreexpresión de SigH,8,14), Pssb (un promotor que solo puede ser activado por la sobreexpresión de ComK1,14), PcomC y PcomF (dos promotores que no pudieron ser activados por ningún regulador14).

Como era de esperar, en un fondo de tipo salvaje, los cuatro promotores se encontraron activados con un porcentaje promedio de células que expresan GFP de 51,87 % para PcomG, 77,26 % para Pssb, 38,32 % para PcomC y 38,56 % para PcomF (Fig. 2 y Figura complementaria 3). Cuando se eliminó sigH, solo se perdió la expresión de PcomG (Fig. 2a). Este resultado confirma que SigH no controla la expresión de todos los genes de transformación genética y que debe estar involucrado al menos un regulador adicional. Curiosamente, cuando se inactivó comK1, se eliminó la expresión de todos los promotores (Fig. 2a-d). Por lo tanto, ComK1 es esencial, junto con SigH, para la expresión del operón comG, pero también es absolutamente necesario, solo, para la expresión de ssb y comC. Curiosamente, la regulación de comF parecía intermedia, ya que la eliminación de comK1 elimina la expresión de comF, mientras que la ausencia de sigH la disminuye casi en un factor doble (Fig. 2d). Finalmente, en un mutante comk2, no se pudo detectar ningún efecto para todos los promotores.

Porcentaje de la población que expresa GFP bajo el control de PcomG (St29, St51, St40 y St 41) (a), Pssb (St50, St61, St64 y St67) (b), PcomC (St48, St60, St63 y St66) ) (c) y PcomF (St233, St235, St234 y St236) (d) en un fondo de tipo salvaje o en ausencia de sigH, comK1 o comK2 se determinó después de 21 h de crecimiento en medio CS2. Los resultados se presentan como media ± SD. Cada experimento se ha repetido al menos cinco veces (repeticiones biológicas). Los experimentos individuales se muestran como círculos azules.

Para completar nuestros resultados (Fig. 2) y caracterizar exhaustivamente los regulones SigH, ComK1 y ComK2, realizamos un análisis transcripcional global mediante secuenciación de ARN comparando el impacto de la eliminación de los genes que codifican estos tres reguladores individuales en la competencia. programa transcripcional.

Primero, nos enfocamos en los genes involucrados en la transformación genética natural (Fig. 3 y Tabla complementaria 1). Los resultados obtenidos anteriormente se confirmaron a pesar de algunas pequeñas diferencias (discutidas en la Nota complementaria 1). En general, tanto SigH como ComK1 resultaron esenciales para la expresión de la mayoría de los genes de transformación genética, con la excepción de ssb, que solo está controlado por ComK1. Una vez más, no se pudo atribuir ningún papel a ComK2. Finalmente, verificamos la eficiencia de transformación de las cepas donde los genes que codifican los reguladores de competencia central se eliminaron individualmente (Fig. 1c). Como era de esperar, solo la ausencia de sigH o comK1 abolió la transformación genética, mientras que un mutante comK2 mostró una eficiencia de transformación comparable a la de una cepa de tipo salvaje (Fig. 1c).

Genes de competencia tardía para los que la expresión es inducida (>2 veces, a) o reprimida (>2 veces, b). Cada círculo de color representa un regulón, cuya expresión es activada o inhibida por SigH (en azul), ComK1 (en amarillo), ComK2 (en verde), o por los tres (fuera del círculo negro). El número de genes en cada categoría se muestra dentro de los círculos o en la intersección entre círculos cuando el mismo gen está controlado por más de un regulador. La siguiente tabla muestra el número total de genes para los que la expresión es inducida o reprimida por un factor doble, triple o quíntuple. Los genes de competencia tardía activados (c) y reprimidos (d) (> 2 veces) también se presentan por función. El número de genes controlados por cada regulador de competencia central (SigH en azul, ComK1 en amarillo y ComK2 en verde) se muestra dentro de los círculos o en la intersección entre círculos cuando el mismo gen está controlado por más de un regulador.

En otros organismos modelo, el programa transcripcional de competencia siempre abarca más genes que solo los genes involucrados en la transformación genética21,22,23,24. Es evidente que también es el caso de S. aureus. De hecho, en comparación con las cepas mutantes sigH, comK1 y comK2, los genes 213/73/95 se sobreexpresaron respectivamente por al menos un factor doble en la cepa de tipo salvaje (Fig. 3a). Además, si consideramos límites de sobreexpresión más altos, la cantidad de genes encontrados sobreexpresados ​​seguía siendo importante, con 84/38/53 genes sobreexpresados ​​por un factor triple e incluso 35/23/31 genes sobreexpresados ​​por un factor quíntuple. . Los números encontrados aquí, especialmente para el factor de expresión triple, son bastante similares a lo que se ha descrito en otros organismos modelo21,22,23,24, que revelan un verdadero conjunto central de alrededor de 100 genes de competencia tardía en S. aureus.

Luego analizamos las funciones asociadas a los genes inducidos durante el programa transcripcional de competencia de S. aureus (Fig. 3c, Tablas complementarias 2-4). Además de los genes de transformación genética natural, encontramos genes implicados en (i) la regulación de la respuesta al estrés (controlada principalmente, pero no exclusivamente, por ComK2), (ii) genes que codifican múltiples sistemas putativos de toxina/antitoxina25 (controlados por los tres reguladores ), (iii) genes implicados en el metabolismo de aminoácidos y ácidos nucleicos (controlados por SigH y ComK2) y (iv) genes implicados en el transporte de hierro (controlados principalmente pero no exclusivamente por SigH). Es importante destacar que nuestros resultados establecieron claramente que, aunque solo SigH y ComK1 son esenciales para la expresión de los genes de transformación genética, los reguladores de competencia central (es decir, SigH, ComK1 y ComK2) son absolutamente necesarios para el desarrollo completo de la competencia transcripcional. programa en S. aureus.

Nuestro análisis transcripcional global también reveló que la expresión de numerosos genes se inhibió durante el desarrollo de la competencia en S. aureus. De hecho, encontramos que un total de 399 genes fueron inhibidos (> 2 veces) en la cepa de tipo salvaje en comparación con las cepas mutantes individuales sigH, comK1 o comK2 (Fig. 3b). Esto representa más del 15% de todos los genes presentes en el genoma de S. aureus N315.

Curiosamente, más del 10% de los genes reprimidos (37 para ser exactos) están directamente involucrados en la virulencia o la regulación de la virulencia (Fig. 3d, Tabla complementaria 5). Entre estos genes se encontraron muchos factores de virulencia bien caracterizados, incluidos genes que codifican para la cápsula (CapA-O), serina proteasas (SplA-F, SspA-C), adhesinas intercelulares (IcaAB), exoproteínas (Hlg, Coa), superficie proteínas (ClfAB, fnb, FnbB, geh, sdrCD, Spa) y una lipasa (Geh). Además, la expresión de un importante TCS conocido por impulsar la expresión de más de 20 factores de virulencia in vivo, saeRS26, se encontró reprimida durante la competencia. Aunque se encontró que todos los reguladores de competencia central estaban involucrados en la represión de la virulencia, SigH y ComK2 desempeñaron un papel importante con una superposición importante entre los genes que cada uno reprime (Fig. 3d, Tabla complementaria 5). Desafortunadamente, una comparación de los exoproteomas mutantes de tipo salvaje y sigH o comK2 no mostró ninguna diferencia significativa en la cantidad de factores de virulencia (Fig. 4 complementaria). Es importante destacar que en nuestras culturas coexisten dos poblaciones, células competentes y no competentes, cada una de las cuales representa el 50% de la población total. Por lo tanto, como las células no competentes siguen produciendo factores de virulencia, se subestimaría el efecto de la inhibición asociada a las células competentes sobre la cantidad total de factores de virulencia producidos en el cultivo. Alternativamente, las células podrían haberse recolectado en un momento que podría no ser apropiado para observar el efecto en el exoproteoma.

Finalmente, se ha demostrado el desarrollo de competencias en S. aureus en diferentes condiciones asociadas a diferentes disponibilidades de oxígeno8. Por lo tanto, nos preguntamos si los TCS sensibles al oxígeno presentes en S. aureus (es decir, SrrAB27, NreBC28 y AirRS29) estuvieron involucrados durante los primeros pasos de regulación de competencia en el curso del crecimiento planctónico en el medio CS2. Para probar tal hipótesis, comparamos la expresión del promotor comG en cepas mutantes de tipo salvaje y srrA, nreC y airR. En este experimento, la eliminación de nreC y airR no afectó la expresión del promotor comG (Fig. 4a). Sin embargo, cuando srrA estuvo ausente, la expresión de comG disminuyó en un factor de siete veces (Fig. 4a). Dado que tanto SigH como ComK1 están involucrados en la expresión del operón comG (Fig. 2a), decidimos determinar qué regulador de competencia central estaba bajo el control de SrrAB. Como se encontró que la expresión de ssb solo estaba controlada por ComK1 (Fig. 2b), finalmente probamos el efecto de la eliminación de srrA en su expresión. En ausencia de srrA, la expresión de ssb no se vio afectada (Fig. 4b). Además, la eliminación de sigH y srrA tuvo el mismo impacto en la expresión de ssb que las cepas mutantes individuales de sigH y srrA (Fig. 4b). En conjunto, estos resultados sugirieron que SrrAB podría activar SigH para controlar la expresión del promotor comG. Además, la implicación de SrrAB en las vías reguladoras que conducen al desarrollo de competencias y la transformación genética implica que la ausencia de srrA debe tener un efecto sobre las eficiencias de transformación genética de S. aureus. De hecho, cuando se eliminó el gen srrA, se observó una disminución de 15 y 19 veces (obtenida respectivamente usando ADN plasmídico o cromosómico) en la eficiencia de transformación genética de S. aureus (Fig. 1c).

a Porcentaje de células que expresan GFP de PcomG en cepas mutantes de tipo salvaje (St29), ssrA (St145), nreC (St158) y airR (St177). Los resultados se presentan como media ± SD. Cada experimento se ha repetido al menos cinco veces (repeticiones biológicas). Los experimentos individuales se muestran como círculos azules. b Porcentaje de células que expresan GFP de Pssb en cepas de tipo salvaje (St50), srrA (St147), sigH (St61) y doble mutante srrA/sigH (St252). Los resultados se presentan como media ± SD. Cada experimento se ha repetido al menos cinco veces (repeticiones biológicas). Los experimentos individuales se muestran como círculos azules.

El TCS con detección de oxígeno permite que S. aureus examine y responda a condiciones microaeróbicas o anaeróbicas. En particular, se ha demostrado que SrrAB es un regulador global de los factores de virulencia en condiciones de bajo oxígeno27. Por lo tanto, es tentador especular que durante el crecimiento de S. aureus en el medio CS2, la concentración de oxígeno disminuyó en el cultivo. Para probar esta hipótesis, finalmente medimos la concentración de oxígeno disuelto durante el crecimiento en CS2 (Fig. 5 y Fig. 5 complementaria). Curiosamente, a medida que la OD comenzó a aumentar, la concentración de oxígeno disminuyó rápidamente. De hecho, mientras que la concentración de oxígeno se mantuvo constante en 21 % durante las primeras 8 h, luego disminuyó a 0,27 % durante las siguientes 6 h, mientras que la DO del cultivo solo alcanzó 0,5. Unos minutos después de que la concentración de oxígeno alcanzara su punto más bajo, el cultivo se detuvo de manera reproducible durante aproximadamente 1 h, potencialmente para adaptarse a estas nuevas condiciones de bajo nivel de oxígeno (Fig. 5). Finalmente, tras la caída en la concentración de oxígeno y la pausa en el crecimiento, comenzaron a emerger células competentes que expresaban GFP (Fig. 5). Por lo tanto, podemos proponer con confianza que usando nuestro protocolo optimizado, el crecimiento en medio CS2 está asociado a una limitación rápida en la disponibilidad de oxígeno, lo que lleva a condiciones microaeróbicas detectadas por SrrAB que a su vez activa SigH para la inducción de competencia en S. aureus.

Una cepa de tipo salvaje (St29) que expresa GFP bajo el control de PcomG se cultivó en un medio CS2 durante 24 h. Cuando el crecimiento se hizo detectable, se midieron la concentración de oxígeno, el porcentaje de células que expresaban GFP y la DO600 nm cada 30 min. A medida que aumentaba la OD, la concentración de oxígeno descendía rápidamente del 21 % al 0,27 %, mientras que la OD solo alcanzaba el 0,5. Es importante destacar que nuestro ensayo nos permite afirmar que no se alcanzan condiciones anaeróbicas completas ya que nuestros sensores pueden medir con confianza concentraciones de oxígeno que son diez veces más bajas. Unos minutos más tarde, el crecimiento marcó una pausa reproducible, probablemente necesaria para que las células se adaptaran a las condiciones de bajo oxígeno, lo que a su vez indujo un aumento en el porcentaje de células competentes que expresaban GFP. Esta figura muestra un experimento representativo que se ha reproducido cinco veces (consulte la Fig. 5 complementaria para ver las réplicas).

Previamente, el trabajo de Fagerlund y sus colegas14 estableció claramente que la sobreexpresión individual o combinada del regulador de la competencia central no era suficiente para inducir el desarrollo completo de la competencia en S. aureus. En este estudio, presentamos un protocolo optimizado que permite la inducción óptima de la competencia genética en S. aureus. Dicho protocolo fue fundamental para conducir el estudio genético aquí propuesto. Es importante destacar que las eficiencias de transformación resultantes detectadas con varias cepas de laboratorio y aislamientos clínicos demuestran en última instancia el verdadero potencial de este mecanismo HGT para modular la plasticidad genética de S. aureus y la adquisición de genes de resistencia a los antibióticos in vivo.

Además, también establecimos que tres reguladores centrales de competencia son esenciales para un desarrollo completo del programa transcripcional de competencias en S. aureus. Si bien ya se conocía la importancia de SigH, demostramos por primera vez la esencialidad de ComK1 para la expresión de los genes involucrados en la transformación genética. Es importante destacar que también revelamos cómo ComK2 está involucrado, junto con SigH y ComK1, en el desarrollo completo del programa transcripcional de competencias (Fig. 6). De hecho, nuestro estudio transcriptómico global muestra claramente que, además de la transformación genética, también se inducen muchas otras funciones durante la competencia, una característica compartida con otros organismos modelo. Será importante investigar en el futuro cómo estos otros procesos biológicos (es decir, respuesta al estrés30, metabolismo de aminoácidos31 y ácidos nucleicos32 o sistemas toxina/antitoxina33,34) participan en el establecimiento de la adaptación ambiental competente.

Se han identificado tres reguladores de competencia central, a saber, SigH, ComK1 y ComK28,14. Los tres reguladores son esenciales para un desarrollo completo del programa transcripcional de competencias. Si bien SigH y ComK1 son absolutamente necesarios para la expresión de genes de transformación genética, ComK2 (junto con SigH y ComK1) también es esencial para la inducción de funciones celulares adicionales (es decir, respuesta al estrés, sistemas de toxinas/antitoxinas, metabolismo de aminoácidos y ácidos nucleicos, hierro transporte…). Además, el desarrollo de la competencia se caracteriza por la inhibición de la virulencia, controlada principalmente por SigH y ComK2. Finalmente, hemos demostrado que el desarrollo natural de la competencia se induce a medida que la concentración de oxígeno en el cultivo disminuye drásticamente. Esta rarefacción de oxígeno probablemente sea detectada por el sistema de dos componentes SrrAB, que a su vez activa el regulador de competencia central SigH.

La presencia y participación de tres reguladores de competencia central en S. aureus, cada uno probablemente inducido por distintas vías de transducción de señales, es una característica sorprendente. El solapamiento de los regulones SigH, ComK1 y ComK2 es otro, aunque dicho solapamiento ya ha sido descrito en Vibrio cholerae, en el que se han identificado dos reguladores de competencia central35. Una hipótesis podría ser que S. aureus necesita múltiples vías reguladoras para integrar una gama más amplia de señales para decidir si se vuelve o no competente para la transformación genética. Según esta hipótesis, varias señales ambientales deberían estar presentes de forma concomitante para permitir el desarrollo óptimo de la competencia genética en S. aureus. Por otro lado, una regulación global tan compleja proporciona múltiples objetivos para modular el desarrollo de competencias cuando S. aureus no se encuentra en estas condiciones óptimas. Curiosamente, ComK2, que no controla la expresión de los genes de transformación genética en ambientes microaeróbicos, podría involucrarse en respuesta a diferentes señales ambientales específicas, complejizando la regulación para el desarrollo de competencia en S. aureus.

Además, es interesante mencionar que la regulación del desarrollo de competencias en S. aureus comparte rasgos con varios organismos modelo históricos importantes: S. pneumoniae y su factor sigma alternativo (ComX), filogenéticamente cercano a SigH13, B. subtilis y su competencia central regulador, ComK, homólogo a ComK1 y ComK214 y V. cholerae a través de la presencia de varios reguladores de competencia central18. Por lo tanto, sería interesante y probablemente importante probar en el futuro si S. aureus también podría utilizar otras características reguladoras presentes en estos organismos modelo históricos para controlar o modular el desarrollo de la competencia.

Finalmente, demostramos cómo la limitación de oxígeno, que conduce a condiciones microaeróbicas detectadas por el SrrAB TCS, controla el desarrollo de competencia en S. aureus. Dado que nuestros cultivos se realizan en tubos cerrados, de manera similar a lo publicado anteriormente36, pensamos que el cultivo de S. aureus en CS2 conduce a un consumo rápido de oxígeno disuelto que no puede ser reemplazado por oxígeno atmosférico. Los resultados de la literatura ya indicaron que S. aureus tenía la capacidad de inducir competencia bajo diferentes concentraciones de oxígeno8,20. La inducción de competencia en condiciones anaeróbicas8, durante la formación de biopelículas20 o en respuesta a ROS37, refuerza aún más esta idea. También propusimos que SrrAB podría activar SigH (a través de la transcripción, traducción o estabilidad) en respuesta a variaciones en la concentración de oxígeno ambiental. Se requerirá trabajo adicional para comprender completamente cómo una disminución en la concentración de oxígeno activa, directa o indirectamente, SigH a través de SrrAB. Curiosamente, el trabajo de Cordero y colegas muestra cómo el desarrollo de competencias está asociado con cambios dramáticos en el metabolismo del carbono37. Sería, por tanto, importante probar si la regulación de la fisiología celular, en respuesta a las limitaciones de oxígeno, podría estar implicada en el desarrollo de la competencia en S. aureus.

Es importante destacar que S. aureus a menudo encuentra condiciones microaeróbicas in vivo. De hecho, durante una infección, los neutrófilos activados que consumen energía desencadenan la deficiencia de oxígeno, mientras que los macrófagos, las células dendríticas y las células T inducen inflamación, lo que altera el flujo sanguíneo a los tejidos y reduce drásticamente los niveles de oxígeno38. Además, se forman microambientes con restricción de oxígeno durante infecciones39 o abscesos40 asociados con biopelículas. Por lo tanto, durante el curso de una infección, S. aureus a menudo se expone a las condiciones ambientales descritas en este manuscrito y conduce al desarrollo de competencia para la transformación genética, reforzando el verdadero potencial de este modo HGT in vivo. Sin embargo, nuestro análisis transcriptómico global también reveló que la transcripción de numerosos genes de virulencia fue reprimida durante el desarrollo natural de la competencia (Fig. 6). Por lo tanto, como modelo in vivo, podemos proponer que durante el curso de una infección, las células de S. aureus inducen la expresión del regulón de virulencia, lo que finalmente conduciría a una deficiencia local de oxígeno. Un porcentaje restringido de la población detecta esta señal ambiental y, en respuesta, induce competencia para la transformación genética en una parte restringida de la población. En última instancia, las células competentes de S. aureus reprimen la virulencia y promueven la HGT, mientras que el resto de la población continúa promoviendo la infección.

Las cepas N3158, RN422041 y USA30042 de S. aureus, así como los aislados clínicos43 utilizados en este proyecto, se enumeran en la Tabla complementaria 6. Las cepas de S. aureus se cultivaron en medio BHI (Becton, Dickinson and Company) o en un medio completamente sintético. medio llamado CS28, dependiendo del experimento. Cuando fue necesario, se utilizaron antibióticos para seleccionar eventos específicos (Kan, 200 µg/mL; Cm, 10 µg/mL).

Las células se aislaron de un stock de -80 ° C en la placa BHI. Se inocularon cuatro clones en 10 mL de BHI y se incubaron a 37 °C con agitación a 180 rpm hasta que la DO alcanzó 2,5. A continuación, este precultivo se centrifugó, se lavó en medio CS2 nuevo y se usó para inocular 10 ml de medio CS2 nuevo (OD = 0,5) en tubos Falcon cerrados de 50 ml. A partir de este cultivo inicial de CS2, se realizaron diluciones seriales de 10 veces para generar 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 y 10-5 cultivos cerrados en tubos Falcon de 50 ml y más si fuera necesario. Se prepararon varios tubos para cada dilución con el fin de tomar muestras individuales a lo largo del crecimiento (es decir, cada tubo Falcon solo se abrió una vez para una muestra). Finalmente, las diluciones se incubaron durante la noche a 37 °C con agitación a 120 rpm. Las células se recogieron cuando la DO estaba entre 2 y 2,2 (cepas indicadoras de GFP, figuras 2 y 3) o durante el crecimiento (cepas indicadoras de GFP, figura 1, mediciones de oxígeno, figura 4).

Los promotores de interés se insertaron en el plásmido pRIT-GFP44 utilizando el método de ensamblaje de Gibson. Los promotores y el plásmido pRIT-GFP se amplificaron primero con cebadores dedicados. Todos los oligonucleótidos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla complementaria 7. En la cola de cada cebador, diseñamos regiones de superposición homólogas de 25 a 50 pb entre los extremos de cada promotor y el plásmido lineal pRIT-GFP. Los promotores y el plásmido pRIT-GFP se amplificaron utilizando la polimerasa de ADN de alta fidelidad Phusion (adquirida a Thermo Scientific). A continuación, todos los fragmentos de PCR se purificaron utilizando una columna de silicio comercial estándar (kit de limpieza de PCR, Macherey-Nagen) y se verificó mediante electroforesis en gel la ausencia de fragmentos de PCR no específicos o menores.

La mezcla maestra de ensamblaje de Gibson se preparó agregando 320 µL de tampón ISO 5x (25 % p/v PEG-8000; Tris-HCl 500 mM, pH 7,5; MgCl2 50 mM; DTT 50 mM; NAD 5 mM; dNTP 1 mM cada uno ), 0,64 µl de 10 U/µl de exonucleasa T5, 20 µl de 2 U/µl de polimerasa Phusion, 160 µl de 40 U/µl de ADN ligasa Taq y 699,36 µl de agua (todos los reactivos se adquirieron en New England Biolabs). Se añadieron cinco microlitros de la mezcla de dos fragmentos de ADN que contenían 100 ng de plásmido pRIT lineal y un exceso de tres veces de insertos a 15 µl de mezcla maestra de ensamblaje Gibson. A continuación, los tubos de reacción se incubaron a 50 °C durante 1 hora. Finalmente, 1 µL de la reacción de ensamblaje se transformó en células de Escherichia coli electrocompetentes IM08B. Las células de E. coli transformadas se incubaron a 37 °C en agar LB con 100 µg/ml de ampicilina.

Para seleccionar los transformantes que contenían el plásmido esperado, se realizó una PCR de colonias. Los plásmidos resultantes se extrajeron de transformantes positivos (cultivos nocturnos) y se purificaron utilizando un kit comercial (kit de extracción NucleoSpin Plasmid, Macherey-Nagen). Todos los plásmidos fueron verificados por secuenciación (empresa GATC). Finalmente, para obtener las cepas indicadoras finales, se transformaron células electrocompetentes de S. aureus con cada plásmido construido.

Con el fin de investigar el papel de los principales genes que se predijo que estarían involucrados en la regulación del desarrollo de la competencia en S. aureus, enumerados en la Tabla S1, se clonaron construcciones de reemplazo alélicas en el plásmido pIMAY44 sensible a la temperatura. Todos los cebadores utilizados para la clonación en el presente estudio se enumeran en la Tabla complementaria 7. Los fragmentos correspondientes a las regiones flanqueantes de 1 kpb de los genes a eliminar se amplificaron a partir del ADN genómico de S. aureus N315 utilizando cebadores flanqueados por sitios de enzimas de restricción compatibles con la clonación múltiple. sitio (MCS) de pIMAY. Las regiones aguas arriba o aguas abajo se digirieron usando las dos enzimas de restricción elegidas y se ligaron en pIMAY, abiertas con las mismas enzimas. Los plásmidos resultantes se electrotransformaron en la cepa IM08B E. coli. Luego se usó Colony PCR para verificar la estructura de los plásmidos presentes en los transformantes. Los plásmidos se purificaron de las colonias positivas utilizando un kit comercial (kit de extracción NucleoSpin Plasmid, Macherey-Nagen). Después de verificar la secuencia del plásmido (empresa GATC), la cepa S. aureus N315ex woϕ se transformó por electroporación y se sembró en agar BHI suplementado con cloranfenicol (10 mg/mL) y se incubó a 28 °C.

Para permitir la integración de pIMAY en el cromosoma, se resuspendió una única colonia de la placa de transformación en 200 µl de BHI. La suspensión se diluyó 10 veces hasta 10-3 y se esparcieron 100 µl de cada dilución sobre BHI suplementado con cloranfenicol (10 mg/ml) y se incubó a 37 °C durante la noche. Al día siguiente, las colonias se sembraron posteriormente en las mismas condiciones. Mientras tanto, se realizó un análisis de PCR de colonias para comprobar la ausencia de pIMAY extracromosómico y si se había producido la integración del plásmido en la región aguas arriba o aguas abajo.

Según los resultados de la PCR de colonias, se realizó un cultivo durante la noche en BHI a 28 °C sin cloranfenicol. A continuación, el cultivo de la noche a la mañana se diluyó 10 veces hasta 10−7. Cientos de microlitros de diluciones 10-4 a 10-7 se sembraron en BHI que contenía 1 µg/mL de anhidrotetraciclina (aTc). Las placas se incubaron a 28 °C durante 2-3 días. A continuación, las colonias se parchearon en placas BHI (sin antibiótico) y BHI complementado con cloranfenicol (10 mg/ml) y se cultivaron a 37 °C durante la noche. Las colonias sensibles al cloranfenicol se cribaron mediante PCR de colonias para identificar los clones que contenían la mutación deseada. Las cepas mutantes fueron finalmente verificadas por PCR y secuenciación de ADN.

Después del crecimiento en CS2, se recogieron 500 µl de células mediante centrifugación a 11.000 g durante 1 min. Los sedimentos se resuspendieron en 500 µl de etanol frío al 70 % y se incubaron en hielo durante 20 min para fijar las células. Luego, las células de S. aureus se resuspendieron en 500 µL de PBS (pH 7,4) después de centrifugar a 11.000 g durante 1 min. Finalmente, se evaluó el porcentaje de la población que expresa GFP mediante citometría de flujo (citometría de banco superior Cytoflex, Beckman-Coulter). Después de la detección de dispersión frontal y lateral para identificar células individuales, se usó un láser de 488 nm para distinguir las células competentes que expresan GFP en comparación con la autofluorescencia de una cepa que no expresaba GFP (St12) (ver Fig. 1a complementaria ).

Es importante mencionar que la GFP es una proteína muy estable. Por tanto, una vez alcanzado el porcentaje máximo de células competentes, este número se mantuvo constante durante horas. Esta característica no significa que la competencia permanezca 'abierta' durante horas, sino que una vez que se alcanza el máximo, no aparecen nuevas celdas competentes.

Después del crecimiento en CS2, las células se recolectaron y trataron como se explicó anteriormente (ver citometría de flujo). Las imágenes de fluorescencia de las células se tomaron utilizando un microscopio de escaneo láser confocal (plataforma ImagerieGif). GFP se excitó a 488 nm usando el láser azul y las imágenes de fluorescencia se recolectaron usando el canal verde. Las imágenes se reconstituyeron utilizando el software ImageJ.

La cepa de tipo salvaje (St12), así como las cepas mutantes comGA (St137), comK1 (St37), comK2 (St38) y sigH (St45) se cultivaron primero hasta alcanzar la competencia utilizando nuestro protocolo de dilución optimizado. Elegimos realizar los experimentos de transformación utilizando el cultivo de dilución -2 para cada cepa. Las células se transformaron naturalmente siguiendo el protocolo previamente publicado8 con algunos ajustes. Brevemente, en cada punto de tiempo (cada media hora), se recolectaron 2 mL de células por centrifugación a 10 000 g durante 1 min a 4 °C, se resuspendieron en 2 mL de CS2 fresco y se dividieron por igual en dos tubos. Se añadió uno o 5 µg de ADN donante (plásmido o cromosoma) a uno de los tubos (el segundo tubo se usa como control "sin ADN") y se incubó a 37 °C durante 2,5 h con agitación a 180 rpm. Diez o 100 µL (tubo con ADN) o 1 mL ("sin control de ADN") de cada tubo finalmente se mezclaron con 25 mL de agar BHI fundido preenfriado a 55 °C junto con un antibiótico, y la mezcla se vertió en placas de Petri. Después de la solidificación, las placas se incubaron a 37 °C durante 48 h. En cada punto de tiempo, la viabilidad también se evaluó por dilución en serie en placas de agar BHI. Las eficiencias de transformación finalmente se calcularon dividiendo el número de transformantes detectados en 1 ml de cultivo por el número total de células en el mismo volumen. Los números presentados en la Fig. 1c representan la media de las eficiencias de transformación más altas detectadas a lo largo del crecimiento durante cada experimento. Los experimentos se han repetido para cada cepa al menos 5 veces para proporcionar una fuerte relevancia estadística.

plásmido. El plásmido pCN34 (Kan45) se usó en algunos de los experimentos de transformación genética (Fig. 1c). pCN34 se purificó a partir de la cepa St197. Brevemente, se recogieron 50 ml de cultivo mediante centrifugación y el plásmido se purificó usando un kit de purificación de plásmidos (Macherey-Nagen).

ADN cromosómico. se usó la cepa St294 para proporcionar ADN cromosómico donante (Fig. 1c, d). En St294, el plásmido pIMAY-INT14 (Cm) se insertó en el cromosoma en el sitio cromosómico INT14. La inserción del plásmido se verificó mediante PCR, mientras que no se pudo detectar ningún plásmido replicante. Brevemente, se centrifugaron 100 mL de cultivo y se resuspendieron en 5 mL de TEG (Tris 5 mM, pH 8; EDTA, 10 mM; Glucosa, 1%) complementado con 500 µL de Proteinasa K (10 mg/mL), 2 mL de lisis tampón (NaOH, 0,2 N; SDS, 1%) y 20 g de perlas de vidrio (Stratech, #11079-105, 0,5 mm de diámetro). Luego, las células se rompieron usando 5 ciclos de vórtice (1 min cada uno) con 1 min en hielo entre cada ciclo. Para finalizar la lisis celular se agregaron 3 mL de buffer de lisis por 5 min a temperatura ambiente y se neutralizó con 6 mL de NaAc (3 M, pH 4.8). Finalmente, el ADN cromosómico presente en el sobrenadante se precipitó utilizando etanol al 96 % (1 ml de EtOH para 500 µL de sobrenadante) después de 2 horas de incubación a -20 °C. Después de la centrifugación, el ADN cromosómico se lavó usando 300 µl de etanol al 70 % frío. Finalmente, el ADN cromosómico precipitado se resuspendió en 300 µl de Tris 5 mM, pH 8.

Muestreo y aislamiento. Los cultivos de S. aureus se cultivaron en medio CS2 a 37 °C y 180 rpm hasta que la OD600 alcanzó 2. Para detener el metabolismo/transcripción celular y estabilizar los ARN, las células se recolectaron mediante centrifugación a 10 000 g durante 1 min a 4 °C y los gránulos se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido antes de almacenarlos a -80 °C. Se recogieron tres réplicas biológicas independientes para cada una de las cuatro cepas (tipo salvaje, St29; ΔcomK1, St40; ΔcomK2, St41; ΔsigH, St61). Para la extracción de ARN, las células se lisaron usando Lysing Matrix B y un instrumento FastPrep (ambos MP Biomedicals), y el ARN se aisló usando el RNeasy Mini Kit (Qiagen). Los ARN se trataron con TURBO DNase (Ambion), se purificaron mediante el protocolo de limpieza de ARN del RNeasy Mini Kit (Qiagen) y se almacenaron a -80 °C. Finalmente se analizó la integridad del ARN usando un Agilent Bioanalyzer (Agilent Technologies).

Agotamiento de ARNr, construcción de bibliotecas y secuenciación. Eliminación de 23 S, 16 S y 5 S rRNA usando el RiboZero rRNA Removal Kit (Epicenter) (dos veces), construcción de bibliotecas específicas de cadena que producen fragmentos de un rango de tamaño de 100 a 500 pb, combinación de las 12 bibliotecas indexadas, secuenciación en un carril de celda de flujo en un instrumento Illumina HiSeq2000 con un protocolo de extremos emparejados de 75 nt, y la demultiplexación de las 12 muestras de lecturas indexadas fue realizada por la "Instalación central de secuenciación de próxima generación (NGS)" del Instituto para la Biología Integrativa de la Cell (I2BC, Gif sur Yvette, Francia).

Leer mapeo y análisis de expresión diferencial. La expresión diferencial de todas las características anotadas se evaluó utilizando el entorno de programación estadística R. Se determinó la expresión diferencial entre las muestras de cepas de tipo salvaje (St29, n = 3) y cada una de las 9 muestras (cada una n = 3) en las que estaban ausentes sigH, comK1 o comK2. El resultado del análisis de expresión diferencial se presenta en las Tablas complementarias 2–5. Los genes con valores de P corregidos de tasa de descubrimiento falso (FDR) < 0,01 y una proporción de expresión diferencial superior a 2, 3 o 5 se consideraron expresados ​​significativamente diferencialmente y se presentan.

Accesibilidad de datos. Todo el conjunto de datos de RNA-seq está compilado y accesible bajo la presentación GEO GSE224932.

Aislamiento de exoproteínas. Se cultivaron cultivos de S. aureus (tipo salvaje, St12; ΔsigH, St45 y ΔcomK2, St 38) en 10 ml de CS2 en tubos Falcon de 50 ml durante 19,5 h. Los sobrenadantes de cultivo se recogieron mediante centrifugación a 6000 rpm durante 10 min (4 °C) para eliminar las bacterias, seguido de filtración a través de un filtro de 0,22 µm para eliminar los restos celulares. Las proteínas de los sobrenadantes del cultivo se precipitaron en ácido tricloroacético (TCA) al 20 % (v/v) a 4 °C durante la noche. Las proteínas precipitadas se sedimentaron por centrifugación a 13000 rpm durante 45 min (4 °C) y los sedimentos se lavaron con etanol al 96 %. Los sedimentos de proteína finalmente se centrifugaron a 13 000 rpm durante 30 min (4 °C), se eliminó el etanol restante y los sedimentos se dejaron secar al aire.

Perfilado de exoproteínas. Las exoproteínas precipitadas se resuspendieron en 18 µl de PBS 1x y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. Después de la adición de 20 µl de tampón 2x ​​Tris-Glycine SDS Novex (ThermoFisher) y DTT 1 M, las muestras se incubaron durante 10 min a 95 °C. Las exoproteínas finalmente se separaron en un gel Tris-Glycin al 4–12 % (Invitrogen) y se visualizaron mediante la tinción de Coomassie.

Preparación de muestras de exoproteínas y análisis LC-MS. Las bandas que contenían toda la muestra se cortaron y se sometieron a digestión con tripsina en gel utilizando condiciones estándar que incluyen reducción y alquilación. Los péptidos generados por tripsina se analizaron mediante nanoLC-MSMS utilizando un sistema de cromatografía líquida nanoElute (Bruker) acoplado a un espectrómetro de masas timsTOF Pro (Bruker). Los péptidos se cargaron en una columna analítica Aurora (ION OPTIK, 25 cm × 75 m, C18, 1,6 m) y se separaron con un gradiente de 0–35 % de disolvente B durante 100 min. El disolvente A era ácido fórmico al 0,1 % y acetonitrilo al 2 % en agua y el disolvente B era acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1 %. Los espectros de MS y MS/MS se registraron desde m/z 100 a 1700 con un rango de exploración de movilidad de 0,6 a 1,4 V s/cm2. Los espectros de MS/MS se adquirieron con el modo de adquisición basado en la movilidad de iones PASEF (fragmentación en serie de acumulación paralela) utilizando una cantidad de exploraciones de MS/MS de PASEF establecidas en 10.

Análisis de los datos. Los datos sin procesar de MS y MSMS se procesaron y convirtieron en archivos mgf con el software DataAnalysis (Bruker). Las identificaciones de proteínas se realizaron utilizando el motor de búsqueda MASCOT (Matrix Science, Londres, Reino Unido) contra la base de datos de S. aureus. Las búsquedas en bases de datos se realizaron utilizando la especificidad de escisión de tripsina con dos posibles escisiones perdidas. La carbamidometilación de las cisteínas se fijó como modificación fija y la oxidación de las metioninas como modificación variable. Las tolerancias de péptidos y fragmentos se establecieron en 10 ppm y 0,05 Da, respectivamente. Las proteínas se validaron cuando se identificaron con al menos dos péptidos únicos. Solo se consideraron los iones con una puntuación superior al umbral de identidad y una tasa de detección de falsos positivos inferior al 1 % (opción de señuelo Mascot). La cuantificación basada en espectrometría de masas se realizó mediante cuantificación sin etiquetas utilizando el método de conteo espectral. Los valores totales de recuento espectral de MS/MS se extrajeron del software Scaffold (versión Scaffold 4.11.1, Proteome software Inc, Portland, OR) filtrados con un 95 % de probabilidad y un 0,1 % de FDR para los umbrales de proteínas y péptidos, respectivamente. Para el análisis estadístico, los valores faltantes que se producen en los conjuntos de datos de recuento espectral a nivel de proteína se imputaron mediante un valor constante fijado en 0,1. Para tener en cuenta la variación dentro de la muestra en los conjuntos de datos de conteo espectral, se realizó una prueba binomial beta basada en análisis MS/MS por triplicado con valores P calculados usando el paquete R 'ibb' (versión 13.06, 61). Las proteínas se filtraron en un valor P < 0,05 y un cambio de pliegue mayor que dos.

Los datos de proteómica de espectrometría de masas se han depositado en ProteomeXchange Consortium a través del repositorio de socios PRIDE con el identificador de conjunto de datos PXD040550 y 10.6019/PXD040550.

Las concentraciones de oxígeno se midieron utilizando los puntos sensores de oxígeno SP-PSt3-SA23-D3-OIW (PreSens GmbH, Regensburg, Alemania). Estos puntos sensores se adhirieron a la pared interior de tubos Falcon de 50 ml con pegamento de silicona para que los puntos siempre estuvieran sumergidos durante los experimentos (es decir, por debajo de la marca de 5 ml). Los tubos Falcon se cerraron en T0 y permanecieron cerrados durante todo el experimento.

Los puntos del sensor están cubiertos con una capa sensible al oxígeno donde el oxígeno molecular apaga la luminiscencia de un complejo de porfirina de metal inerte inmovilizado en una matriz permeable al oxígeno. Este proceso garantiza una alta resolución temporal y una medición sin deriva ni consumo de oxígeno.

La vida útil de la fotoluminiscencia del luminóforo dentro del punto del sensor se midió utilizando una fibra óptica de polímero conectada a un medidor de oxígeno (Fibox 4 trace; PreSens GmbH). La luz de excitación (505 nm) fue suministrada por una fibra de vidrio, que también transportó la señal de fluorescencia emitida (600 nm) de regreso al medidor de oxígeno. Brevemente, se realizó una medición de oxígeno, a través del plástico del tubo Falcon, simplemente acercando la fibra óptica desde el punto del sensor. En cada punto de tiempo, la concentración de oxígeno se midió tres veces y los resultados proporcionados representan la media de estas tres mediciones. En nuestros experimentos, la concentración de oxígeno se midió cada 30 min.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todo el conjunto de datos de RNA-seq está compilado y accesible bajo la presentación GEO GSE224932. Los datos de proteómica de espectrometría de masas se han depositado en ProteomeXchange Consortium a través del repositorio de socios PRIDE con el identificador de conjunto de datos PXD040550 y 10.6019/PXD040550. Todos los demás datos están disponibles del autor correspondiente a petición razonable. Los datos de origen están disponibles como tabla de datos complementarios.

Gordon, RJ & Lowy, FD Patogénesis de la infección por Staphylococcus aureus resistente a la meticilina. clin. Infectar. Dis. 46, S350–S359 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Klevens, RM Infecciones invasivas por Staphylococcus aureus resistente a la meticilina en los Estados Unidos. Mermelada. Medicina. Asoc. 298, 1763 (2007).

Artículo CAS Google Académico

Dietz, I., Jerchel, S., Szaszák, M., Shima, K. y Rupp, J. Cuando el oxígeno se agota: el microambiente impulsa las interacciones huésped-patógeno. Los microbios infectan. 14, 311–316 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Beenken, KE et al. Expresión génica global en biopelículas de Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 186, 4665–4684 (2004).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hiramatsu, K. et al. Staphylococcus aureus multirresistente y quimioterapia futura. J. infectar. Quimioterapia. 20, 593–601 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Centros de Control y Prevención de Enfermedades. (CENTROS PARA EL CONTROL Y LA PREVENCIÓN DE ENFERMEDADES). Las mayores amenazas. Disponible en http://www.cdc.gov/drugresistance. (2013).

Lindsay, JA Variación genómica y evolución de Staphylococcus aureus. En t. J.Med. Microbiol. 300, 98–103 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Morikawa, K. et al. La expresión de un gen del factor sigma secundario críptico revela la competencia natural para la transformación del ADN en Staphylococcus aureus. Patog de PLoS. 8, e1003003 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Solomon, JM & Grossman, AD Quién es competente y cuándo: regulación de la competencia genética natural en bacterias. Tendencias Genet. 12, 150–155 (1996).

Artículo CAS PubMed Google Académico

van Sinderen, D. et al. comK codifica el factor de transcripción de competencia, la proteína reguladora clave para el desarrollo de competencia en Bacillus subtilis. mol. Microbiol. 15, 455–462 (1995).

Artículo PubMed Google Académico

Meibom, KL, Blokesch, M., Dolganov, NA, Wu, CY y Schoolnik, GK La quitina induce la competencia natural en Vibrio cholerae. Ciencia 310, 1824–1827 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Lee, MS & Morrison, DA Identificación de un nuevo regulador en Streptococcus pneumoniae que vincula la detección de quórum con la competencia para la transformación genética. J. Bacteriol. 181, 5004–5016 (1999).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Morikawa, K. et al. Un nuevo factor sigma estafilocócico en el casete del gen conservado: significado funcional e implicación para los procesos evolutivos. Genes Cells 8, 699–712 (2003).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Fagerlund, A., Granum, PE y Havarstein, LS Staphylococcus aureus genes de competencia: mapeo de los regulones SigH, ComK1 y ComK2 mediante secuenciación transcriptómica. mol. Microbiol. 94, 557–579 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Chung, YS, Breidt, F. & Dubnau, D. Localización de la superficie celular y procesamiento de las proteínas ComG, necesarias para la unión al ADN durante la transformación de Bacillus subtilis. mol. Microbiol. 29, 905–913 (1998).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Solomon, JM, Magnuson, R., Srivastava, A. & Grossman, AD Las vías de detección convergentes median la respuesta a dos factores de competencia extracelular en Bacillus subtilis. Genes Dev. 9, 547–558 (1995).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Moreno-Gámez, S. et al. La detección de quórum integra señales ambientales, densidad celular e historial celular para controlar la competencia bacteriana. Nat. común 8, 854 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Lo Scrudato, M. & Blokesch, M. La red reguladora de competencia natural y transformación de Vibrio cholerae. PLoS Genet. 8, e1002778 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Le, KY & Otto, M. Regulación de detección de quórum en estafilococos: una descripción general. Frente. Microbiol. 6, 1174 (2015).

Maree, M. et al. La transformación natural permite la transferencia de resistencia a la meticilina mediada por SCCmec en biopelículas de Staphylococcus aureus. Nat. común 13, 2477 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Berka, RM et al. Análisis de micromatrices del estado K de Bacillus subtilis: cambios de expresión en todo el genoma dependientes de ComK. mol. Microbiol. 43, 1331–1345 (2002).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Ogura, M. et al. Análisis del genoma completo de genes regulados por el factor de transcripción de competencia ComK de Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 184, 2344–2351 (2002).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dagkessamanskaia, A. et al. Interconexión de los regulones de competencia, estrés y CiaR en Streptococcus pneumoniae: la competencia desencadena la autolisis de fase estacionaria de las células mutantes de ciaR. mol. Microbiol. 51, 1071–1086 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Peterson, SN et al. Identificación de genes sensibles a feromonas de competencia en Streptococcus pneumoniae mediante el uso de microarreglos de ADN. mol. Microbiol. 51, 1051–1070 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Kato, F., Yoshizumi, S., Yamaguchi, Y. e Inouye, M. Detección de todo el genoma para la identificación de nuevos sistemas de toxina-antitoxina en Staphylococcus aureus. aplicación Reinar. Microbiol. 85, e00915–e00919 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, Q., Yeo, W. & Bae, T. El sistema de dos componentes SaeRS de Staphylococcus aureus. Genes 7, 81 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Yarwood, JM, McCormick, JK & Schlievert, PM Identificación de un nuevo sistema regulador de dos componentes que actúa en la regulación global de los factores de virulencia de Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 183, 1113–1123 (2001).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schlag, S. et al. Caracterización del regulón NreABC sensible al oxígeno de Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 190, 7847–7858 (2008).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sol, F. et al. AirSR, un sistema de dos componentes que contiene grupos [2Fe-2S], media la detección global de oxígeno y la señalización redox en Staphylococcus aureus. Mermelada. química Soc. 134, 305–314 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Claverys, J.-PP, Prudhomme, M. & Martin, B. Inducción de regulones de competencia como respuesta general al estrés en bacterias grampositivas. año Rev. Microbiol. 60, 451–475 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Lichev, A., Angelov, A., Cucurull, I. & Liebl, W. Los aminoácidos como factores nutricionales y (p)ppGpp como alarma de la respuesta estricta regulan la transformación natural en Micrococcus luteus. ciencia Rep. 9, 11030 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Macfadyen, LP y col. El desarrollo de competencias por parte de Haemophilus influenzae está regulado por la disponibilidad de precursores de ácidos nucleicos. mol. Microbiol. 40, 700–707 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Findlay Negro, H. et al. Un sistema toxina-antitoxina regulado por competencia en Haemophilus influenzae. PLoS ONE 15, e0217255 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chan, WT & Espinosa, M. El sistema toxina-antitoxina Streptococcus pneumoniae pezAT reduce la resistencia a los betalactámicos y la competencia genética. Frente. Microbiol. 7, 1322 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Jaskólska, M., Stutzmann, S., Stoudmann, C. & Blokesch, M. Regulación dependiente de QstR de la competencia natural y la secreción de tipo VI en Vibrio cholerae. Ácidos Nucleicos Res. https://doi.org/10.1093/nar/gky717 (2018).

Cafini, F. et al. Metodología para el estudio de la transferencia génica horizontal en Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. https://doi.org/10.3791/55087-v (2017).

Cordero, M. et al. La inducción de competencia natural adapta el metabolismo estafilocócico a la infección. Nat. común 13, 1525 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Balasubramanian, D., Harper, L., Shopsin, B. & Torres, VJ Patogénesis de Staphylococcus aureus en diversos entornos de acogida. Pato. Dis. https://doi.org/10.1093/femspd/ftx005 (2017).

Wilde, AD et al. Respuestas hipóxicas bacterianas reveladas como determinantes críticos del resultado huésped-patógeno mediante el análisis TnSeq de la infección invasiva por Staphylococcus aureus. Patograma de PLOS. 11, e1005341 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Vitko, NP, Spahich, NA y Richardson, AR Dependencia glucolítica de resistencia al óxido nítrico de alto nivel y virulencia en Staphylococcus aureus. MBio 6, e00045–15 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Kreiswirth, BN et al. El gen estructural de la exotoxina del síndrome de shock tóxico no se transmite de forma detectable por un profago. Naturaleza 305, 709–712 (1983).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Fey, PD et al. Un recurso genético para la detección fenotípica rápida y completa de genes no esenciales de Staphylococcus aureus. mBío. 4, e00537-12 (2013).

Pourcel, C. et al. Ensayo de repetición en tándem de número variable de locus múltiple mejorado para el genotipado de Staphylococcus aureus, que proporciona una técnica altamente informativa junto con un fuerte valor filogenético. J. Clin. Microbiol. 47, 3121–3128 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Monk, IR, Shah, IM, Xu, M., Tan, M.-W. & Foster, TJ Transformando lo intransformable: aplicación de transformación directa para manipular genéticamente Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis. MBio 3, e00277–11 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Charpentier, E. et al. Nuevo sistema de vector lanzadera basado en cassette para bacterias grampositivas. aplicación Reinar. Microbiol. 70, 6076–6085 (2004).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Descargar referencias

Agradecemos a Kazuya Morikawa y Tarek Msadek por proporcionar cepas y construcciones de S. aureus y por los debates científicos. También queremos agradecer a las instalaciones de citometría de flujo y proteómica (SICaPS) de Imagerie-Gif (Instituto de Biología Integrativa de la Célula, I2BC, Gif sur Yvette, FRANCIA) por su ayuda y apoyo. También reconocemos la experiencia en secuenciación y bioinformática del centro de secuenciación de alto rendimiento I2BC, respaldado por France Génomique (financiado por el Programa Nacional Francés "Investissement d'Avenir" ANR-10-INBS-09).

Este trabajo fue apoyado por una "beca para jóvenes investigadores" de la Agencia Nacional de Investigación de Francia a Nicolas Mirouze (ANR-18-CE35-0004 GenTranSa) y una beca de doctorado del Chinese Scholarship Council (CSC) otorgada a Shi Yuan Feng.

Estos autores contribuyeron igualmente: Shi Yuan Feng, Yolande Hauck.

Universidad Paris-Saclay, CEA, CNRS, Instituto de Biología Integrativa de la Célula (I2BC), 91198, Gif-Sur-Yvette, Francia

Shi Yuan Feng, Yolande Hauck, Fedy Morgene, Rosa Mohammedi y Nicholas Mirouze

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

SYF: Conceptualización, metodología, investigación; YH: Conceptualización, metodología, investigación; FM: Conceptualización, metodología, investigación; RM: Metodología, investigación; NM: Conceptualización, supervisión, redacción—revisión y edición, administración de proyectos y adquisición de fondos

Correspondencia a Nicolás Mirouze.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: George Inglis y Tobias Goris. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Feng, SY, Hauck, Y., Morgene, F. et al. La compleja regulación de la competencia en Staphylococcus aureus en condiciones microaeróbicas. Comun Biol 6, 512 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04892-1

Descargar cita

Recibido: 19 julio 2022

Aceptado: 28 de abril de 2023

Publicado: 12 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04892-1

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.